自從與瑪戈（米蘭達(dá)·卡斯格拉夫 Miranda Cosgrove 配音）、伊迪絲（達(dá)娜·蓋伊 Dana Gaier 配音）和阿格蕾絲（埃爾希·費(fèi)舍 Elsie Fisher 配音）三個(gè)可愛的小女孩實(shí)現(xiàn)宿命的邂逅，曾經(jīng)的大壞蛋格魯（史蒂夫·卡瑞爾 Steve Carell 配音）可真徹底轉(zhuǎn)型了，他金盆洗手，轉(zhuǎn)而化身為慈祥可親的爸爸和做得一手爛口味布丁果凍的商人。當(dāng)然凡事沒有盡善盡美的，在此期間，憧憬大壞蛋傳奇人生的老搭檔納法利歐博士（拉塞爾·布蘭德 Russell Brand 配音）離他而去，另謀高就。某天，格魯被身懷絕技卻魯莽的特工露西·王爾德（克里斯汀·韋格 Kristen Wiig 配音）綁架，原來露西所在的集團(tuán)研制出可以改變生物基因的藥物，可他們位于北極圈的實(shí)驗(yàn)室被神秘竊賊偷走，因此才委托有過壞蛋經(jīng)驗(yàn)的格魯做臥底。經(jīng)過一番考慮，格魯接受了這項(xiàng)任務(wù)，帶著超萌的小黃人們，和露西組成了爆笑連連的追兇搭檔……

蜘蛛俠（托比?馬奎爾 Tobey Maguire 飾）在經(jīng)歷了重重考驗(yàn)之后，成為了人人敬仰的正義英雄，抱得美人歸。但是，光環(huán)下蜘蛛俠，也有自己的心病：他在第一集時(shí)放走了小偷導(dǎo)致最親愛的叔叔被小偷殺死，帕克一直耿耿于懷。 　　生活順意的帕克開始變得目中無人，當(dāng)他再次抓到那個(gè)小偷時(shí)，殘忍地看著他從樓上摔下致死，過后才發(fā)現(xiàn)自己懲罰錯(cuò)了人，真兇是“沙人”。當(dāng)帕克將“沙人”殘忍殺死后，帕克心內(nèi)的陰暗面漸漸在帕克的身體內(nèi)占據(jù)了上風(fēng)，蜘蛛俠最終演變成邪惡的“毒蜘蛛”！糟糕的是，帕克沒有察覺到自身的變化，帕克最終如何擺脫自身的邪惡？